Effect of main carotenoid of saffron, Crocin, on Hsp70 and Hsp90 expression in breast cancer cell line, MDA-MB-468

Abstract

Background: Breast cancer is the most common cancer among women worldwide. Because of the cyto-protective and anti-apoptotic roles of Heat shock proteins (HSP) increased growth, metastasis and chemo-resistance in cancer cells. Therefore, the inhibitors of HSPs especially Hsp70 and Hsp90 highly have been regarded. In this study, we investigated the effect of main carotenoid of saffron, crocin, on the expression of Hsp70 and Hsp90 in human breast cancer cells (MDA-MB-468). Methods: In this in vitro study, the cancerous (MDA-MB-468) and normal (MCF-10A) breast cells cultured then, treated with various concentration of crocin (0-5 mg/ml) at different times (0-72 h), and their cell viability measured by MTT assay. In this test, the anti-cancer drug cisplatin used as a positive control. Also, the effect of effective doses of crocin (1.5 and 3 mg/ml) on cell colony formation ability in soft agar analyzed at 16 days. Then, RNA of the treated cells with 1.5 mg/ml crocin extracted at 12-48 h. Finally, after cDNA synthesis, the expression of Hsp70 and Hsp90 mRNA level investigated using quantitative real-time PCR. Data were analyzed using student's t-test. Results: The MTT data revealed that the crocin inhibited significantly proliferation of breast cancer cells in dose- and time dependent manner (P < 0.001) like the anticancer drug cisplatin; While, crocin have inhibition effect on normal cells proliferation more less than cancerous cells. So that, the IC50 values of crocin at 24, 48 and 72are 3 ± 0.03, 2.5 ± 0.01 and 2.1 ± 0.03, respectively. On the other hand, crocin significantly decreased colony formation of cancer cells with inhibition rate about 91 and 94 % in effective doses of crocin (1.5 and 3 mg/ml, respectively) (P < 0.001). The treated cells (1.5 mg/ml crocin) markedly decreased the expression of Hsp70 and Hsp90 mRNA levels (P < 0.001). Conclusion: Our results showed that crocin is the anti-proliferation agent for breast cancer cells. The decreased expression of anti-apoptotic proteins such as Hsp70 and Hsp90 may be one of action mechanisms of crocin

مقدمه و هدف: سرطان پستان شایعترین سرطان در بین زنان سراسر جهان می باشد. پروتئین های شوک حرارتی به علت نقش محافظتی و ضد آپوپتوزی خود رشد تومور، توانایی متاستاز و مقاومت به شیمی درمانی را در سلول های سرطانی افزایش می دهند، از همین رو مهارکننده های پروتئین های شوک حرارتی بویژه پروتئین های شوک حرارتی 70 و 90 بسیار مورد توجه محققین قرار گرفته اند. در مطالعه حاضر اثر کروسین بر بیان ژن پروتئین های شوک حرارتی 70 و 90 در سلول های سرطانی پستان انسانی (MDA-MB-468) مورد بررسی قرار گرفته است. مواد و روش ها: در مطالعه ای تجربی، پس از کشت سلول های سرطانی (MDA-MB-468) و نرمال (MCF-10A) پستان، سلول ها با غلظت های متفاوت کروسین (5-0 میلی گرم بر میلی لیتر) در زمان های مختلف (72-0 ساعت) تیمار شدند و توانایی بقاء سلول های مورد نظر با روش MTT اندازه گیری شد. در این روش از داروی ضد سرطان سیس پلاتین به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید. همچنین، اثر غلظت های موثر (1/5 و 3 میلی گرم بر میلی لیتر) کروسین بر توانایی تشکیل کلونی سلول های سرطانی در آگار نرم طی 16 روز بررسی شد.سپس،RNA در زمان های 48-12 ساعت از سلول های سرطانی تیمار شده با 1/5 میلی گرم بر میلی لیتر کروسین استخراج و بعد از سنتز cDNA، بیان ژن های پروتئین شوک حرارتی 70 و 90 در سطح mRNA با استفاده از روش PCR کمی زمان واقعی ارزیابی شد. تست های مربوط به هر نمونه به صورت سه تکرار انجام و داده ها با استفاده از آزمون student's t-test آنالیز شدند. یافته ها: نتایج حاصل از MTT نشان داده است که کروسین همانند داروی ضدسرطان سیس پلاتین (کنترل مثبت) در یک رفتار وابسته به غلظت و زمان به صورت معنی داری تکثیر سلول های سرطانی پستان را مهار می کند (P<0/001) در حالی که تنها در برخی از غلظت ها اثر معنی داری بر رشد سلول های نرمال پستان داشته، به علاوه اینکه، این اثر مهاری بر رشد، در مقایسه با سلول های سرطانی قابل توجه نمی باشد. غلظت موثر کروسین برای سلول های سرطانی پستان در 24، 48 و 72 ساعت، به ترتیب 0/03 ± 3، 0/01 ± 2/5 و 0/03 ± 2/1 میلی گرم بر میلی لیتر بدست آمد. کروسین ضمن مهار رشد سلول های سرطانی پستان، توانایی تشکیل کلونی آنها را حدود 91 و %94 به ترتیب در غلظت های 1/5 و 3 میلی گرم بر میلی لیتر مهار می کند (P<0/01). سلول های تیمار شده با غلظت موثر کروسین (1/51 میلی گرم بر میلی لیتر) به طور معنی داری کاهش بیان ژن های پروتئین شوک حرارتی 70 و 90 در سطح mRNA را نشان داده اند (P<0/001). نتیجه گیری: نتایج ما نشان دادند که کروسین یک عامل ضد رشد و تکثیر سلول های سرطانی پستان بوده و ممکن است یکی از مکانیسم های احتمالی این اثر آن، کاهش بیان پروتئین های ضد آپوپتوزی پروتئین های شوک حرارتی 70 و 90 باشد