Evaluation the frequency of BRAF mutation among patients with colorectal cancer referred to Imam Reza hospital of Birjand durin 2008-2014

Abstract

Objective: Colorectal cancer is a multi-step process characterized by a sequence of genetic alterations in cell growth regulatory genes, such as BRAF. The BRAF mutation is reported in variety of human malignancy with varied frequency as an important biological marker for therapeutic guidance in colorectal cancer. Due to lack of data on incidence of BRAF mutation in south of khoarasan we sought to analyze the incidence of BRAF mutation in these patients. Material and method: first, we evaluate 3 procedures to improve current methodology (salting out) for DNA isolation. We extracted DNA from 50 FFPE tissues obtained hospitals from patients with colorectal cancer in south of khorasan. Methods involving deparaffinization on slides or tubes, overnight enzyme digestion and DNA isolation using salting out method and a silica-based commercial kit, were compared in terms of yields, concentrations and the amplifiability. Finally, DNA extracted from paraffin-embedded tissue with improved method and exon 15 of the BRAF gene was PCR amplified and subjected to sequencing. Results: We successfully isolated DNA from samples described above. High-quality DNA was obtained with a mean PCR success rate of 43% compared with commercial kit (22%) (Pv= 0.001). The efficiency of DNA extracted in improved method was significantly increased compared to commercial kit (Pv= 0.09). BEAF mutation was detected in 2/43 (4%) of patients with colorectal cancer. There was correlation between stage and differentiation of tumor but no correlation was found between sexes nor with the age of patients. Conclusion: The results suggested that DNA extracted using improved method has many unique characteristic and applied to isolate acid nucleic in a safe and effective manner. This technique allowed further reliable molecular analysis. In order to low incidence of BRAF mutation in south of khoarasan further work is necessary to study prevalence of HNPCC cases in south of khoarasan and also try to understand the interaction between genetics and environmental factors that contribute to this low incidence of BRAF mutations in this region

مقدمه: با توجه به شیوع و شدت سرطان کولورکتال، آنچه که بیشتر در مورد سرطان کولورکتال اهمیت پیدا می کند مساله تشخیص زودرس و جراحی این تومور است. موتاسیون BRAF V600E یکی از شایعترین تغییرات ژنتیکی است که در سرطان کولورکتال رخ می دهد. موتاسیون در این ژن از علل مقاومت به شیمی درمانی و رادیوتراپی بیماران مبتلا می باشد از طرفی استفاده از بازدارنده های این ژن هدف مهمی برای ساخت داروهای ضد سرطان خواهد بود. لذا در این مطالعه علاوه بر یافتن روشی مناسب جهت استخراج بهینه DNA از بافت های پارافینه، فراوانی موتاسیون ژن BRAF در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال در استان خراسان جنوبی مورد بررسی قرار گرفته است. روش کار: در این مطالعه تعداد 50 بیمار مبتلا به سرطان کولورکتال در یک دوره 5 ساله جمع آوری شدند. استخراج DNA از نمونه های پارافینه در سه روش مورد مقایسه قرار گرفت. سپس موتاسیون BRAF V600E به روش واکنش زنجیره ای پلیمراز و سپس با روش تعیین توالی نوکلئوتیدها مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج: کیفیت DNA استخراج شده در روش دستی بهبود یافته در مقایسه با کیت تجاری بالاتر بود (pv=0.09)، و همچنین قابلیت تکثیر نیز در روش بهبود یافته (43%) در مقایسه با کیت (22%) بالاتر بود (pv=0.001). از طرفی موتاسیون BRAF در 2 مورد از 50 مورد به صورت هتروزیگوت مثبت مشاهده شد. بین مرحله تومور و درجه تمایز ارتباط معنی داری مشاهده شد. نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان می دهد با توجه به کیفیت DNA استخراج شده با روش دستی بهبود یافته، این روش برای آنالیز های مولکولی مناسب است. علاوه بر این با توجه به اینکه بعضی از بیماران مبتلا به سرطان دارای جهش در ژن BRAF بودند آگاهی از وضعیت جهش BRAF و قسمت های دیگر آبشار RAS/RAF در پیش بینی پاسخ به درمان های anti EGFR در بیماران مبتلا ضروری می باشد. از طرفی با توجه شیوع پایین این موتاسیون در سرطان کولورکتال غیر ارثی در جمعیت مورد مطالعه (مشابه با سایر مطالعات که فراوانی این موتاسیون را پایین گزارش کرده اند)، لذا پیشنهاد می شود بیماران استان خراسان جنوبی از نظر سرطان کولورکتال ارثی که مشخصه آن نبود موتاسیون در ژن BRAF است و نیز بررسی ارتباط بین فاکتورهای محیطی و ژنتیکی که می توانند در پایین بودن فراوانی این موتاسیون نقش داشته باشند، نیز مورد بررسی قرار گیرند